發(fā)布時間： 2017年07月25日
說到“克隆”這個詞，很多人會想到世界上第一例運用這項技術(shù)培育出的動物——克隆羊“多莉”，它標志著生物體通過體細胞進行無性繁殖的克隆技術(shù)成為現(xiàn)實。隨后，克隆豬、克隆牛等紛紛問世，克隆犬直至2005年才問世。犬被科學界普遍認為是最難克隆的動物之一，該領(lǐng)域的技術(shù)一直被韓國所壟斷。
中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學研究員帶領(lǐng)希諾谷公司科研團隊及廣州生物院實驗室團隊，借助Cas9基因編輯技術(shù)，首先獲得兩只基因編輯犬“蘋果”和“葫蘆”，之后，科研人員以“蘋果”體細胞作為克隆犬供體細胞，優(yōu)化克隆技術(shù)平臺，突破技術(shù)瓶頸，成功培育出“蘋果”的克隆犬“龍龍”。這標志著我國成為繼韓國之后第二個獨立掌握犬體細胞克隆技術(shù)的國家。
犬體細胞克隆困難重重
2005年世界首例體細胞克隆犬“史努比”在韓國誕生，此后，犬體細胞克隆技術(shù)就一直掌握在韓國人手中，從未被其他國家突破。克隆犬是世界性難題，面臨許多困難：首要問題就是如何獲得足夠數(shù)量成熟卵母細胞。豬、牛、羊等動物通過體外成熟培養(yǎng)技術(shù)可獲得大量的成熟卵母細胞，而犬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)效率極低，只能從體內(nèi)獲取成熟卵母細胞。體內(nèi)成熟卵母細胞的獲取，需要精確掌握犬發(fā)情排卵時間，而一旦錯過一次發(fā)情排卵時間，需要等上半年或一年才有下一次機會。準確把握排卵時間十分困難，通過血清測定孕激素個體間差異大，難以確立一個統(tǒng)一的評判標準。沖卵時間過早，卵母細胞未成熟；時間過晚，卵母細胞已老化。如何精確掌握犬發(fā)情排卵時間，是獲取高質(zhì)量成熟卵母細胞的關(guān)鍵。
其次，一只犬平均排卵7-8枚，排出的卵子處于GV期，需要在輸卵管內(nèi)停留48-72h到達MⅡ期。犬卵母細胞中富含脂類物質(zhì)，顏色較深，黏性很大，顯微操作較困難，體細胞電融合效率不高。
最后，犬胚胎移植中受體與供體間在生殖生理階段上難以保持一致性。妊娠率低，再加上克隆技術(shù)本身的低效率問題，使得犬體細胞克隆更是難上加難，需要投入大量的財力、人力和物力。
基因編輯，神奇的剪刀
2013年一種新的基因編輯技術(shù)（CRISPR/Cas9）風靡全球，它具有構(gòu)建簡單方便、基因打靶效率高等特點。它究竟有多神奇？它可以讓基因想要就要、想沒就沒，隨心所欲；并成功在牛、羊、豬、兔、小鼠、大鼠等動物及人類胚胎中實現(xiàn)基因修飾。它是否同樣能在犬基因組中發(fā)揮作用呢？帶著這樣的好奇心，我們從2013年開始著手犬基因編輯研究。
實驗過程并非如原先設(shè)計的一帆風順，一年的努力并未收到預(yù)期的結(jié)果。幾經(jīng)周折，幾次更改實驗方案，神奇的剪刀終于發(fā)揮了神奇的功能，2014年6月底，世界首例基因（MSTN）敲除狗“大力神”與“天狗”誕生。四個月時，“大力神”與“天狗”就表現(xiàn)出超強運動能力，且“天狗”還具有明顯“雙肌”性狀。
神奇的剪刀還在續(xù)寫著它的神奇，2016年10月，我們著手犬APOE基因敲除，有了前期的基礎(chǔ)研究后，實驗進展非常順利，2016年12月29日，世界首例動脈粥樣硬化疾病模型犬“蘋果”誕生。20天后，另一只APOE基因敲除犬“葫蘆”誕生。故事還在不斷上演，神奇的剪刀還在不斷創(chuàng)造新的神奇。
從世界首例基因敲除犬到基因敲除體細胞克隆犬
這個奇妙的故事還得從2012年說起。當時最初的想法就是做基因敲除體細胞克隆犬，這對于我們來說幾乎是零基礎(chǔ)，唯一的資源就是韓國人發(fā)表的一些沒有具體細節(jié)的文章。起初，犬的發(fā)情排卵時間鑒定都摸不著頭腦，我們經(jīng)過長達一年時間的不斷摸索，才逐步掌握其中規(guī)律。由于前期的基礎(chǔ)較差及實驗條件的限制，先前的體細胞克隆實驗并未獲得成功。2013年，第三代最新基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9正如火如荼展開，我們首先想到將此技術(shù)運用到犬基因編輯中。經(jīng)過將近一年的努力，世界首例肌肉生長抑制素基因敲除犬就這樣誕生了?！按罅ι瘛焙汀疤旃贰钡恼Q生，讓團隊的每個人都非常激動，大家的努力與堅持換來了最終的成功。從開始到成功，足足花了兩年多的時間。這兩年時間里，大家經(jīng)歷了一次又一次失敗，而正是對失敗的不斷反思與改進，堅持不懈，才最終取得成功?？蒲械牡缆飞希褪切枰环N不服輸?shù)木瘛?/span>
基因編輯犬做出來了，但體細胞克隆還未取得成功，賴良學研究員帶領(lǐng)北京希諾谷研發(fā)團隊及廣州生物院實驗室團隊繼續(xù)攻克這一世界性難題。提到世界首例基因敲除克隆犬“龍龍”，還得從它的供體“蘋果”說起。“蘋果”出生于2016年12月29日，是通過Cas9技術(shù)敲除APOE基因的基因編輯犬?！疤O果”出生后，它的皮膚細胞就被保存下來了，之后研發(fā)人員用“蘋果”的細胞進行體細胞克隆，幾次實驗后，2017年5月28日，世界首例基因敲除體細胞克隆犬“龍龍”誕生，之后另兩只同樣的克隆犬也誕生。這標志著我國成為繼韓國之后第二個獨立自主掌握犬體細胞克隆技術(shù)的國家，同時，首次實現(xiàn)犬基因敲除體細胞克隆。
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